نقش اپی ژنتیک در ناباروری و اختلالات ژنتیکی در باروری آزمایشگاهی
این مطلب به لحاظ علمی به تایید آقای دکتر ناصر سلسبیلی متخصص جنین شناسی رسیده است.
IVF و کشت جنین، یک درمان موثر برای ناباروری است. اگرچه هزینه های بالای مصرف گنادوتروپین ها ریسک سندرم تحریک پذیری بیش ازحد (هایپر اوولاسیون) را بالا می برد و تحریک مکرر تخمدان و هورمون ها خود می تواند منجربه سرطان گردد.
IVM یک روش مناسب و جایگزین می باشد. IVM برای به حداقل رساندن مصرف داروهای هورمونی و جلوگیری از سندرم های ذکر شده می باشد. تاکنون بیش از ۱۰۰۰ نوزاد ازطریق روش های IVM به دنیا آمده اند، به ویژه دربیماران PCO اما هنوز روش های IVM به عنوان یک موضوع بحث برانگیز در بیشتر گونه ها، به ویژه در انسان باقیمانده است.
ژنوم اوسیت در طی میوز و در زمان لقاح دوباره سازماندهی می شود. برنامه ریزی اپی ژنتیکی در مرحله ای از گامتوژنز و امبریوژنز اتفاق می افتد و این برنامه ریزی منجر به بیان دوباره الگوی ژن imprinting و خاموش شدن یا فعال شدن ژن ها می شود که در طی رشد و بلوغ اووسیت آشکار می شوند که نسبت به فاکتورهای محیطی آسیب پذیر هستند که تغییرات اپی ژنتیکی را در آن ها القاء می کند و باعث اختلال در بیان ژن و سرانجام نقایص یا فقدان جنینی می شوند.
تغییرات در برخی از ژن های imprint در اووسیت یا جنین موجود در محیط کشت، این احتمال را بوجود آورده است که روش های IVM بر متیلاسیون DNA در طی بلوغ اووسیت تاثیر می گذارد. اگر چه اثر IVM در پروسه تغییرات هیستونی در اووسیت یک مکانیسم مهم دیگری در برنامه ریزی اپی ژنتیکی است اما هنوز اثبات نشده است.
تغییرات هیستون شامل استیله شدن و متیلاسیون لیزین و آرژنین، فسفریله شدن سرینوتیرونین، یوبیکوئینه شدن لیزین و همچنین ribosylation می باشند.
مطالعات اخیر نشان داده است که این تغییرات هیستونی نقش مهمی در تنظیم بیان ژن در سلول های میتوتیک دارند. IVM میزان لقاح، کلیواژ و ظرفیت تکاملی را کاهش می دهد.
در مطالعات ما اثر استیله شدن هیستون در اووسیت، در جنین با کلیواژ اولیه و در زمان دو سلولی بررسی و تائید شده است که IVM بر کیفیت اووسیت در طی پروسه برنامه ریزی اپی ژنتیکی اثرگذار می باشد. بعد از IVM میزان حاملگی پایین و توقف رشد جنین افزایش یافته و افزایش میزان بلاستومر مولتی نوکلئار و آنیوپلوئیدی گزارش شده است که علل آن ها هنوز ناشناخته است ولی تغییرات اپی ژنتیکی را یکی از علل آن به شمار می آورند.
این دانشمندان الگوی متیلاسیون در ژن های Oct4٬ Nanog٬ Sox2٬ fox3ر
مکانیسم اپی ژنتیک شامل متیلاسیونDNA ، تغییرات پروتئین هیستون و تغییرات کروماتین که در نتیجه فعال شدن یا خاموش شدن ژن های مختلف می باشد. مبدا والدی بر بیان ژن تاثیر می گذارد و یک مکانیسمی را تحت عنوان genomic imprinting بوجود می آورد که در طی این مکانیسم، کروموزوم های پدری و مادری به وسیله ماشین رونویسی سلول تشخیص داده می شود.
اگرچه مبدا تکاملی ژنومیک imprinting بین پستانداران و سایرحیوانات متفاوت است ولی، این پدیده تقریبا در مدل های حیوانی بیشتر بررسی شده است. ژنومیک imprinting بوسیله تغییرات اپی ژنتیک تنظیم می شود. Imprinting یک تغییراپی ژنتیکی است که در germ line برنامه ریزی می شود و منجر به بیان monoallelic در برخی از ژن ها می شود. اپی ژنتیک شامل متیلاسیونDNA ٬ تغییرات هیستونی، RNA غیره کننده می باشد. مطالعات بیشتر تاکید بر متیلاسیون DNA دارند اما باز هم شواهدی وجود دارد دال بر اینکه دو مورد دیگر هم در آن نقش دارند.
متیلاسیون DNA شامل repression بیان ژن imprint که اغلب درمناطق CPG در مناطق پروموتور می باشد. اطلاعات کمی در مورد متیلاسیون DNA در اووسیت در زمان قبل از لقاح وجود دارد، زیرا بدست آوردن اووسیت های بالغ در مقادیر کافی مشکل است. به علاوه بیشتر مطالعات انجام شده در مدل حیوانی است که همراه با سوپر اوولاسیون برای افزایش شمار اووسیت است گرچه خود سوپر اوولاسیون بر پدیده متیلاسیون DNA تاثیرگذار است.
اطلاعات کمی در مورد شناخت متیلاسیون پروموتور در اووسیت پستانداران وجود دارد. شیوع برخی اختلالات imprinting نظیر سندرم آنجلمن افزایش می یابد. مطالعات نشان داده که کشت جنین هم در انسان و هم درحیوانات با ریسک زیادی از ابنورمالیتی جنینی و جفتی همراه است. تاکنون بیش از ۸۰ ژن به عنوان imprint در ژنوم موش و انسان Imprinting مادری که در طی رشد اووسیت وارد آن می شود شناخته شده است.
ژنومیک imprinting شامل سه پروسه می باشد:
- درگامت ها بیان شود.
- در بافت های سوماتیک نگهداری شود.
- به نسل بعد در گامت ها نیز منتقل شود.
Imprintingenomic در ارگانیسم های از قبیل پستانداران٬ گیاهان و حشرات نیز اتفاق می افتد. اگرچه مکانیسم مولکولی آن هنوز ناشناخته است ولی مطالعات در پستانداران نشان داده است که چنین مکانیسمی باید ۴ ویژگی داشته باشد:
- مکانیسمی برگشت پذیر باشد.
- بتواند رونویسی را ساپرس کند.
- در طیف فرایند گامتوژنز باید impose شود.
- نشانه خاص والدی در تمام سلول دیپلوئیدی imprinting باید دوباره بیان شود.
درپدیده ژنومیک imprinting متیلاسیون DNA بیشتر و دقیق تر مطالعه شده است زیرا این متیلاسیون ویژگی های آتی پدیده ژنومیک imprinting را توضیح می دهند. بهترین مثال آن فشرده شدن ژن در گامت مونث است که ایجاد کروموزوم × غیرفعال را می کند.
متیلاسیون DNA یک تغییر اپی ژنتیکی است که به عنوان یک مارکر قابل تشخیص در یک آلل پدری در بیان ژن های خاص می باشد. بیان imprint در germ line ابتدا در موش نشان داده شد. اکتساب imprint در طیف رشد post natal در موش اتفاق می افتد. بنابراین حک کردن٬ بیان٬ نگهداری یک پروسه دینامیک می باشد که باید به طور صحیح برنامه ریزی شود. این متیلاسیون در باقیمانده اسیدهای آمینه در محل های CPG اتفاق می افتد و هایپر متیله شدن این جزایر عمدتا با فشرده شدن ژن همراه است.
تجربیات اخیر در موش ترانس ژنیک ارتباط بین متیلاسیون و ژنومیک imprinting را مشخص کرده است. بخش مهمی از ترانس ژن ها برای بیان بیش از حد ژن که هایپرمتیله می شود استفاده می گردد. از اواخر سال ۱۹۸۰ تا ۱۹۹۰ شواهد جدید در ژنومیک imprinting عمدتا از موش ها
برای اولین بار الگوی متیلاسیون ترانس ژن درموش های نوع outbred cD1 انجام شد. مطالعات انجام شده درموش های ترانس ژنیک نشان می دهد که متیلاسیون DNA یک نوع تغییر اپی تحت عنوان genomic imprinting ژنتیکی است.
در اکثریت نژادها ترانس ژن های وراثتی مادری متیله می شوند درحالی که نوع پدری متیله نمی شوند. یک حالت استثنا وجود دارد که یک هماهنگی مستقیم بین وراثت پدری را نشان می دهد که ژن هم متیله می شود و هم بیان می گردد و بر عکس آن وراثت مادری است که متیله می شود اما بیان نمی شود.
مطالعات نشان داده که الگوهای متیلاسیون در ترانس ژن های پدری و مادری در بلوغ سلول های germ cell و نیز در زمان لقاح و تکامل اولیه جنین وجود دارد. درگامت های مونث در حالت کامل ژن ها غیر متیله هستند تا اینکه الگوی مادری فورا تحت بلوغ میوزی قرارگیرد. البته این الگوی متیلاسیون در اووسیت لقاح نیافته و بدنبال فرایند لقاح بدون تغییر می ماند. گامت های مادری در روز ۱۳ حاملگی کاملا غیرمتیله هستند و این الگو تا روز ۱۷ در جنین حفظ می گردد. آلل مادری الگوی متیلاسیون را در طی ۳ روز بعد از امبریوژنز حفظ می کند اما آلل پدری هنوز الگوی بلوغ راکسب نکرده است. حتی در جنین در مراحل اولیه آلل های پدری و مادری پروسه متیلاسیون حتی در زمان قبل از اکتساب الگوی بلوغ خیلی متفاوت دارند .
برنامه ریزی اپی ژنتیکی در دوره هایی از گامتوژنزو امبریوژنز اتفاق می افتد. این برنامه ریزی منجر به بیان دوباره الگوهای ژن imprinting و خاموش شدن یا فعال شدن ژن ها می شود در طی رشد و بلوغ اووسیت آشکار شده که آن ها نسبت به فاکتورهای محیطی آسیب پذیر هستند و ممکن تغییرات اپی ژنتیکی را در آنها القاء کند و باعث اختلال در بیان ژن و سرانجام نقایص یا فقدان جنین می شود.
تغییرات در برخی از ژن های imprint در اووسیت یا جنین موجود در محیط کشت این احتمال را بوجود آورده است که روش های IVM بر متیلاسیون DNA در طی بلوغ اووسیت تاثیر می گذارد. اگر چه اثر IVM بر پروسه تغییرات هیستونی در اووسیت یک مکانیسم مهم در برنامه ریزی اپی ژنتیکی است اما هنوز این موضوع ثابت نشده است.
تغییرات هیستون شامل متیلاسیون لیزینوآرژنین٬ استیله شدن و فسفریله شدن سرینوتیرونین٬ یوبیکوئینه شدن لیزین همچنین ribosylation است. مطالعات نشان داده است که این تغییرات هیستونی نقش مهمی در تنظیم بیان ژن در سلول های میتوتیک دارد. IVM احتمال دارد با اکتساب Imprinting و یا حفظ آن تداخل داشته باشد. در مطالعات انجام شده متیلاسیون ژن H19 را در مراحل مختلف بلوغ اووسیت های بالغ (MI ٬MII ٬GV)در IVM را تعیین کرد و تائیدی بر تحقیقات انجام شده پیش تر شود.
درطی ۱۰ سال گذشته IVM پیشرفت های زیادی داشته است و مطالعات می دهد که ۶۲ تا ۸۰ درصد از اووسیت های بالغ در ۴۳ تا ۵۴ ساعت کشتبه مرحله میوز ۲ می رسند که این به تاریخچه بیماری در فرد وابسته است. کشت طولانی بیش از ۴۸ ساعت باعث افزایش ریتم بالغ شدن سلول و باعث تکامل تا بلاستوسیت می شود. در این مطالعات کشت ۲۴ ساعت استفاده شده است. که باعث کاهش نیاز به گنادوتروپینها دارد که یک جایگزین مناسب برای جمع آوری اووسیت برای سیکل IVF هست.
نکته مهم دیگر این که مقالات اخیر نشان داده تکنیک کمک باروریART باعث ایجاد یکسری اشتباهات imprint به ویژه در سندرم BWS می شود که این سندرم در ارتباط با imprint غیرنرمال ژن H19 می باشد.
یکی دیگر از این نقایص شامل (Large offspring syndrome(Los در استفاده از تکنیک ART ایجاد می شود که شامل متیلاسیون نابجای ژن IGF2R است.
محیط کشت IVM
محیط کشت مورد استفاده برای IVM یک نقش اساسی برای تکامل امبریو و بیان فیزیولوژیکی در جنین را دارد. این موضوع هم در موش و هم در انسان نشان داده شده است. تکنیک های کمک باروری با یک افزایش اختلالات اپی ژنتیکی دربچه هایی که متولد شده اند دیده شده است.
در یک مطالعه، اخیرا نشان داده شده است که یک ارتباط بین سوپر اوولاسیون و اختلال در متیلاسیون ژن imprinted در بلاستوسیت وجود دارد. در این مطالعه مقایسه پروفایل متیلاسیون از دو ژن مادری شامل Snrpn و peg3 نشان داده شده است. در مطالعه دیگر اثرات محیط کشت را در تکامل امبریو نشان داده شده است. محققان حالات متیلاسیون را در ۳ ژن imprint را بر روی بلاستوسیست در ۴ محیط کشت مقایسه کرده اند و مشاهده کردند که تغییرات هیستونی یک نقش مهمی در طی اووژنز دارند.
اووسیت بالغ در موش بسیاری از زیر واحدهای H1 و در اووسیت میوز ۲ در موش هر ۴ هیستون اصلی را بیان می کند. این فرضیه وجود دارد که بیشتر هیستون ها در mRNA مادری در اووسیت ها در mRNA مادری در اووپلاسم ذخیره و در طی تکامل امبریو ترجمه می شود. همچنین مارکرهای اپی ژنتیکی مشخصی برای تشکیلgerm line نرمال در طی تکامل امبریونیک اولیه ضروری هستند. اختلال اپی ژنتیکی در استفاده از تکنیک ART یک مثالی از این گونه مشکلات است و هر دوی مشکلات ژنتیکی و اپی ژنتیکی در ناباروری شرکت دارند.
اووسیت در محیطIVM در اکتساب کامل بازسازی دچار شکست می گردد. زیرا باعث اختلال در استیله شدن می گردد. سطح استیله شدن هیستون H3 یک معیار برای ارزیابی استیلاسیون عمومی هیستون در کروماتین می باشد. ژنوم اووسیت در طی میوز دوباره سازماندهی می شود و به دنبال آن در زمان لقاح نیز به همین صورت می باشد. برنامه ریزی اپی ژنتیکی در دوره ای از گامتوژنز و امبریوژنز اتفاق می افتد و این برنامه ریزی منجر به بیان دوباره الگوهای ژن imprinting و خاموش شدن یا فعال شدن ژن ها می شوند. در طی رشد و بلوغ اووسیت آشکار شده است که نسبت به فاکتورهای محیطی آسیب پذیر هستند که تغییرات اپی ژنتیکی را در آن ها القاء می کند و باعث اختلال در بیان ژن و سرانجام نقایص یا فقدان جنین می شود. تغییرات در برخی از ژن های imprint در اووسیت یا جنین موجود در محیط کشت این احتمال را بوجود آورده است که روش های IVM بر متیلاسیون DNA در طی بلوغ اووسیت تاثیر می گذارد.
اثر IVM بر پروسه تغییرات هیستونی در اووسیت یک مکانیسم مهم دیگری در برنامه ریزی اپی ژنتیکی است اما هنوز ثابت نشده است. تغییرات هیستون شامل استیله شدن و متیلاسیون لیزین وآرژنین٬ فسفریله شدن سرین وتیرونین٬ یوبیکوئینه شدن لیزین همچنین ribosylation است. مطالعات نشان داده است که این تغییرات هیستونی نقش مهمی درتنظیم بیان ژن در سلولهای میتوتیک دارد. انجام IVM ریتم لقاح، کلیواژ و نیز ظرفیت تکاملی را کاهش می دهد.
در یک مطالعه اثر استیله شدن هیستون را در اووسیت، در امبریو با کلیواژ اولیه و در زمان دو سلولی بررسی و تائید شده است که IVM بر کیفیت اووسیت درطی پروسه برنامه ریزی اپی ژنتیکی اثرگذار می باشد. توانایی رشد فولیکول درمحیط کشت به دوز هورمون LH بستگی دارد.
در یک مطالعه استفاده از اووسیت bovin برای تعیین موتاسیون اپی ژنتیکی ۳ ژن imprint و استفاده از دو سیستم IVM مختلف (MSof٬TCM199) بررسی شده است. استفاده از اووسیت MII و بلاستوسیت در موش سبب می شود که imprinting مادری اتفاق افتد. در طی رشد اووسیت و اکتساب متیلاسیون با افزایش قطر اووسیت و سایز نرمال همراه است. مطالعات اولیه در موش مشخص می کند که در کشت ۱۲ روزه منجر به از دست دادن متیلاسیون در IGF2 و PEG 1 و کسب متیلاسیون H19 می گردد. محققان نتیجه گیری کردند که اختلال در پروسه imprinting در طی رشد اووسیت نتیجه ای از همین in vitro folliculogenesis می باشد.
در طی رشد اووسیت ظرفیت از سرگیری میوز و توانایی تکامل امبریو به تدریج بدست می آید و نیاز به یک فعل و انفعال صحیح بین اووسیت و سلول های فولیکول دارد و ظرفیت تکاملی زمانی که سن اووسیت کم و زیاد باشد کاهش می یابد بنابراین لقاح اووسیت های خیلی مچور و یا ایممچور نتایجی از نقایص تکاملی می باشد.
در چندین گونه از قبیل موش، انسان، میمون انتقال NSN به SN در طی رشد اوسیت را داریم و این انتقال با خاموش شدن رونویسی در طی in vivo و نیز در in vitro همراه است. ژنوم اووسیت های متمایز شده برای تولید امبریوهای totipotent در طی میوز یا لقاح دوباره برنامه ریزی می شوند. اگر چه اطلاعات کمی درباره تغییرات اپی ژنتیکی مسئول برای بازسازی ژنوم وجود دارد اما اخیرا گزارش شده است که دی استیله شدن هیستون در اووسیتهای موش در طی میوز اتفاق می افتد نه در میتوز. استیله شدن هیستون های هسته نشان داده شده است که یک نقش مهم در تنظیم بیان ژن دارد از طریق تولید تغییرات conformational در ساختار کروماتین جایی که DNA قابل دسترسی برای فاکتورهای رونویسی در اینترفاز باشد.
استیله شدن، به عنوان یک مارکر اپی ژنتیکی در انتقال اطلاعات از یک نسل به نسل بعد عمل می کند.
مطالعات نشان داده است که سیتوپلاسم اووسیت شامل فعالیت های بازسازی در سلول های متمایز شده می باشد و دلالت بر فاکتور های سیتوپلاسمی اووسیت در دی استیله شدن در زمان میوز را دارد.
فولیکول آنترال با یک اووسیت حاوی ژرمینال وزیکول که حاوی یک کروماتین متراکم (SN) و یک کروماتین پراکنده (NSN) می باشد همراه است. در موش طی رشد اووسیت و زمانی که ظرفیت تکاملی آن زیاد می شود انتقال از NSN به SN صورت می گیرد. در استفاده از گنادوتروپین ها این انتقال از NSN به SN با خاموش شدن ژن ها در محیط in vivio و in vitro صورت می گیرد. همچنین این انتقال با عبور از مرحله پره آنترال به مرحله آنترال همراه است.
در بلوغ اووسیت ها عناصر متفاوتی دخالت دارند که شامل:
بلوغ هسته شامل شروع مجدد میوز و پیشرفت به سمت میوز II.
بلوغ سیتوپلاسمی و بلوغ ژنومی هر دو در سراسر رشد اووسیت وجود دارد. بلوغ ژنومی شامل تغییراتی درتوالی ساختار DNA می باشد که در تنظیم بیان ژن نیز دخالت دارد.
اووسیت درمرحله ژرمینال وزیکل باعث بیان (interferon regulatory factor(Irf9) می شود.
رتینوئیک اسید باعث القاء Irf1 می شود. این ماده یک فرم فعال ویتامین A است که باعث رشد سلولی و بلوغ اووسیت می شود. همچنین رتینوئیک اسید باعث بلوغ سیتوپلاسم در اووسیت bovin از طریق تلفیق بیان ژن در سلولهای کومولوس – گرانولوزا می شود. البته اضافه کردن فرم سیس رتینوئیک اسید به مدیوم محیط کشت حاوی کمپلکس اووسیت –کومولوس باعث افزایش تکامل امبریو می شود.
لپتین یک ماده دیگری است که به وسیله آدیپوسیت ها سنتز می شود. اضافه کردن این ماده به محیط IVM باعث افزایش رسیدن اووسیت Pig به مرحله MII می شود و نقش لپتین هم در بلوغ اووسیت و هم در بلوغ هسته می باشد.
دکتر ناصر سلسبیلی – استاد دانشگاه علوم پزشکی تهران